[생화학실험]Western Blot

소개글

생화학실험 Western Blot 예비및결과 레포트 입니다.
원리 자세히 나와있으며 점수도 괜찮게 받은 레포트이니 많은 도움 되었으면 합니다.

목차

1.실험목적
2.실험기구및 시약
3.실험원리
1)Western blot 원리
Overview of Immunoblotting
Antibody
Blocking
Detection
2)Western blotting의 3단계
3)효소의 항체 결합 방법
4.실험 방법
5.실험결과

본문내용

1. 실험의 목적
면역검출법에 의한 특정 시료의 분석
3. 실험 원리
전기영동 기술은 생체 용액에 있는 개개의 단백질 성분을 분리하는데 기본적인 기술이었다. 종이나 전분(starch), agarose등이 단단하고, 반응성이 없으며, 대류성이 없어서 전기 영 동 기술에 많이 이용되었으나 현재는 polyacrylamide가 전기영동의 대부분에 이용되고 있다. 그러나 이 재료의 우수성만으로는 특정 단백질의 검출에는 이용할 수 없다. 1979년 Towbin은 전기영동 시킨 polyacrylamide gel로부터 무수한 구멍이 있는 nitrocellulose membrane으로 단백질을 이동시켜 단백질의 항체 검출하는 방법을 고안하였다.
Blotting은 SDS-PAGE에 의해 분리된 단백질들을 모세관 작용 혹은 전기영동 상에 의해 분리 젤로부터 지지막(supporting membrane)으로 옮기는 과정을 말한다.
1. Overview of Immunoblotting
Immunoblotting이란 western blotting 이라고도 불린다. 기본 원리는, cell extracts로부터 특정 protein을 detection하기 위해서 먼저 gel electrophoresis를 이용하여 size별로 분리해낸다. 이 과정에서 protein을 순수하게 size별로 분리해 내기 위해서, protein의 단위 질량당 charge와 3차원 folding 구조를 모두 같게 해줘야 한다. 이런 이유로, protein은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행한다.
2. Antibody
protein을 immunoblotting을 할 경우에, 우리는 반드시 그 protein의 epitope을 하나라도 알아야 하며, 그래야만 나중에 antibody를 이용해서 detection 할 수 있다. 보통 antibody를 얻는 방법으로, protein을 토끼에 injection하고, 혈액을 뽑아내서 centrifugation 시킨 후에, 혈청만 얻어낸다. 이 혈청 안에 있는 IgG를(혈청 통째로) goat(양)에 다시 주사한다. 이렇게 하면, 첫 번째 혈청 안에는 protein에 대한 1차 antibody가 형성되고, 양의 혈청 안에는 2차 antibody가 형성되어 이용할 수 있게 된다. 이번 실험에서 이용할 protein은 EF-2(100kD)에 대한 1차 항체와 이 1차 항체를 다시 detection해낼 2차 항체를 이용하게 된다.

참고 자료

없음