서강대학교 현대생물학실험1 6XHis tagged eGFP 발현과 정제 및 정량/정성적 특징 확인

소개

2024년 1학기에 수강한 현대생물학실험1의 두번째 레포트입니다.

목차

1. Astract
2. Introduction
3. Materials & Methods
4. Results
5. Discussion
6. References

본문내용

본 실험은 eGFP를 발현하고 정제한 후, 정량적 및 정성적 특징을 확인해 보았다. Green Fluorescent Protein(GFP)는 Aequorea Victoria에서 발견한 단백질로, 에너지를 흡수한 뒤 509nm 파장에서 녹색 형광을 방출한다. 본 실험에서는 GFP를 변형한 enhanced Green Fluorescent Protein(eGFP)을 사용한다. eGFP는 더 센 형광을 나타내며 extinction의 최대 파장은 488nm, emission의 최대 파장은 509nm이다. 단백질 정제를 위해 재조합 유전자 서열에 특정 DNA 서열을 넣어 단백질에 tagging함으로써 짧은 단백질이 같이 발현되는 protein tagging 방법을 사용하는데 본 실험에서는 6개의 Histidine(His)를 목적 단백질의 N-terminus 혹은 C-terminus에 부착하는 6xHis-tag를 이용한다. 6xHis-tag된 단백질은 pET28a(+) vector에서 ITPG로 인해 과발현되고 과발현된 목적 단백질을 얻기 위해 초음파를 사용해 세포나 세포 구조체를 파괴하는 Sonication을 한 뒤, Immobilized metal ion affinity chromatography(IMAC)로 6x His-tag된 eGFP를 elution해 정제하여 sample들을 준비한다. Sample들을 ultrafilteration하여 불순물을 제거하고 Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis(SDS-PAGE)를 실행해 단백질을 크기에 따라 분리하고 확인하였다. 그리고 extinction coefficient assay와 Lowry assay를 진행해 단백질을 정량했다. 두 방법은 단백질이 특정 파장의 빛을 흡수를 함을 활용한 것이며, Lowry assay는 Biuret method의 변형으로 Cu^+가 Folin-Ciocalteu reagent와 반응해 진한 청색을 띄게하는 원리이다.

참고자료

· Nelson, David L, Cox, Michael M.(2023), 레닌저 생화학(상), 제8판, 월드사이언스, p. 84~90
· Gold, Victor(1987), Compendium of chemical terminology : IUPAC recommendations, Blackwell Scientific Publications, p.154, p.1403
· Tsien RY(1998), ‘‘The green fluorescent protein’’, Annual Review of Biochemistry, p. 510~544