[A]서강대학교 현대생물학실험2_3차 풀레포트_DNA Ligation & Transformation, Mini-scale preparation of plasmid DNA Restriction enzyme & Gel electrophoresis

소개

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목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Materials & Methods
4. Results
5. Discussion
6. References

본문내용

Abstract
제한효소를 처리하여 얻어낸 insert DNA를 T4 DNA ligase를 이용하여 vector에 삽입한다. DNA strand의 5’에 존재하는 인산기와 3’에 존재하는 OH기 사이에 phosphodiester bond를 형성하여 ligation하고, ligation product를 competent cell에 형질전환한 다음 plate에 ampicillin resistance에 의해 생성된 colony를 selection한다. Mini-prep을 통해 colony로부터 plasmid DNA를 추출하여 정제하는데, 염기성 조건에서 plasmid DNA와 chromosomal DNA의 denaturation정도의 차이와 다시 중성조건에서 두 DNA의 renaturation 정도의 차이를 이용하여 plasmid DNA를 분리해낸다. 이후 분리한 plasmid DNA에 제한효소를 처리하여 insert DNA 와 vector를 분리하고 전기영동을 통해 확인한다. Vector와 insert DNA를 ligation한 colony의 수가 vector only colony보다 많이 생성되었고, vector only는 self-ligation이나, 두 제한효소에 의해 cut되지 않은 요인에 의해 colony를 형성할 수 있었다. Ligation 효율을 늘리기 위해 온도를 조절하는 방법을 고려하였고, mini-prep수율을 늘리기 위해 plasmid DNA의 손상을 최소화하여야 한다. 제한효소를 이용하여 insert DNA와 vector를 분리한 다음 전기영동을 통해 확인해준 결과는 6kb와 5kb사이에서 band가 형성되었으며, 750bp에도 band가 형성되었다. 따라서, 제한효소가 정상적으로 double cut 하여 insert DNA와 vector가 linear 형태로 분리되었음을 알 수 있다.

참고자료

· KUHN, Heiko; FRANK‐KAMENETSKII, Maxim D. Template‐independent ligation of single‐stranded DNA by T4 DNA ligase. The FEBS journal, 2005, 272.23: 5991-6000.
· Suzuki M, Hayashi H, Mizuki T, Maekawa T, Morimoto H. Efficient DNA ligation by selective heating of DNA ligase with a radio frequency alternating magnetic field. Biochem Biophys Rep. 2016 Oct 15; 8:360-364
· Dave Nelson, Michael Cox (2021) Lehninger principles of biochemistry, eighth edition, W. H. Freeman, pp.1155-1179
· Geoffrey M. Cooper (2019), The Cell_ A Molecular Approach, 8th ed, Oxford University Press, pp.129-136
· Neil A. Campbell et al. (2017) - Biology_ A Global Approach (Global Edition) 11 edition, Pearson, pp.450-455