14주차_SDS page

목차

I. Purpose

II. Theory
1. SDS-PAGE의 원리
2. DTT의 역할
3. Staining의 종류
4. emGFP의 excitation과 emission

III. Apparatus/reagent

IV. Procedure
1. 단백질 샘플 준비 및 denaturation
2. SDS-PAGE
3. Staining

V. Data&Results
1. Sample preparation
2. SDS PAGE 결과

VI. Discussion

본문내용

Purpose: 13주차에 정제해 둔 단백질을 SDS-PAGE와 fluorescence Spectrophotometer를 이용하여 분석한다.

Theory
1. SDS-PAGE의 원리
SDS-PAGE는 Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel eletrophoresis의 약자로, 5~250kDa 사이의 단백질을 분리할 때 사용되는 방법이다. 이 방법을 이용하면 단백질의 구조와 전하가 이동속도에 주는 영향이 제거된다. SDS-PAGE에 사용되는 polyacrylamide gel은 핵산의 전기영 동과 마찬가지로 농도가 높을수록 pore의 크기가 치밀해지면서 작은 크기의 단백질을 더욱 세밀하게 분리할 수 있다. Gel은 종류에 따라 disk, 수직, 수평 형으로 나눌 수 있다. 다음으로 SDS는 음이온성 surfactant로, 는 1.4 : 1(g)의 비율로 단백질에 결합한다. 즉, SDS가 단백질의 전체 질량에 비례해서 결합하기 때문에, 전하의 영향을 배제하고 size에 의해 이동속도가 결 정된다. 단백질에는 SDS 뿐만 아니라 β-mercaptoethanol이나 DTT같은 reducing agent가 첨가 된다. Reducing agent는 단백질의 residue가 형성한 disulfide bond를 변성시키는 역할을 한다. 이렇게, 3차원 구조가 파괴되고 linear해진 단백질은 SDS에 의해 (-)전하를 나타내므로, 전기장 을 가했을 때 분자 크기에 따라 서로 다른 속도로 (+) 극을 향해서 이동하며 분리된다.

2. DTT의 역할
DTT는 dithiothreitol, strong reducing agent로, protein을 denaturation시키는데 활용된다. 단 백질은 1차 구조뿐만 아니라 2, 3, 4차 구조를 갖는데 이러한 구조에 disulfide bond가 기여한 다.

참고자료

· Jeremy, M.Berg, Biochemistry, 8th, W. H. Freeman 2015, 71~81