western blot

소개

"western blot"에 대한 내용입니다.

목차

1. objective
2. gel loading& running Material
3. electro-transfer material
4. blocking metarial
5. result
6. cussion

본문내용

objective
단백질 혼합물로부터 분리된 특정 단백질을 identification
principle
electro transfer
-sds-page로 크기대로 분리한 단백질 그대로 Nitrocellulose membrane에 electro transfer하는것으로 gel과 밀착시켜 앞뒤로 전기를 걸어주면 gel에 있는 단백질들이 앞 또는 뒤로 빠져나와 membrane에 붙는다.
이때 transfer buffer는 (Tris-base, glycine, 20% methanol)인데 20%methanol이 들어가는 이유는 gel에서 membrane으로 단백질이 잘 빠지도록 돕고 남아있는sds-detergent가 떨어져나와 membrane에 단백질이 순수하게 흡착되도록 한다.
blocking, 항원-항체반응
-AP단백질만을 인식하는 항체를 membrane에 붙여서 확인한다. 만약 항체가 AP에 특이적이라면 band가 보일 것이다.
항체도 단백질이기 때문에 막에 단백질들 사이 빈자리에 비특이적으로 붙을수 있기 때문에 빈 부분을 비특이적인 단백질(skin milk, bovine serum)을 이용해서 코팅하고 항체가 자기의 항원 ( AP) 에만 특이적으로 결합하게 한다.

BSA는 혈장 내에 다량 함유되어 있는 단백질로서 총단백질의 약 60%를 차지하고 있다. skim milk는 우유에서 지방을 제거한 우유이다. BSA는 여러 단백질보다는 항체가 반응하지 않는 한가지 단백질로 blocking을 할 때 사용하며 skim mlik는 casein이라는 단백질이 들어있는데 casein은 phosphorylation된 형태로 존재하기 때문에 Phospho form specific antibody가 binding 할 가능성이 많다. 또한 skim milk에는 단백질 뿐만 아니라 여러종류의 carbohydrate가 들어있기 때문에 이들이 일부 antibody의 antigen과의 recognition site를 masking할 가능성이 있다.

참고자료

· https://www.abcam.com/protocols/general-western-blot-protocol
· https://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot
· http://slidesplayer.org/slide/11304172/
· https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=151315&cid=50331&categoryId=50331