Anti-inflammatory effect of dexamethasone in LPS-treated Raw264.7 cells

소개

"Anti-inflammatory effect of dexamethasone in LPS-treated Raw264.7 cells"에 대한 내용입니다.

목차

1. Introduction
2. Method & Material
3. Result
4. Discussion

본문내용

1. Introduction

dexamethasone(이하 dexa)은 항염증 효과가 있는 것으로 알려진 합성 부신피질호르몬제로, 프로스타글란딘(PG)의 전구물질인 아라키돈산의 생성을 막거나 면역 세포의 활성을 낮추는 기전을 갖는다. 한편, Raw264.7 cell에 LPS를 처리하여 염증반응을 유도하면, TLR-4에 의해 신호가 전달되어 NF-κB가 활성화되고 PG 생성에 관여하는 COX-2의 발현양이 증가하게 된다.
이번 실험은 염증반응이 유도된 세포에 dexa를 처리하여 dexa가 COX-2 mRNA의 양을 줄임으로써 항염증효과를 나타내는지 확인하는 것이 목적이다. 따라서 mRNA의 정량을 위해 cell로부터 순수한 mRNA를 추출하고 이를 cDNA로 바꾼 뒤 PCR을 통해 증폭시킨 후 전기영동을 한다. 이후 대조군과 intensity를 비교하면 dexa의 항염증효과를 파악할 수 있다.

2. Method & Material

Cell prep

1) Raw264.7 cell을 6-well에 seeding 후 O/N 배양한다.
2) control, LPS 1µg/mL, dexamethasone 0.5µM, LPS 1ug/mL + dexamethasone 0.5µM를 각각 처리한다.
3) 24시간 후 dish를 ice위에 3분간 올려두고 PBS로 wash한다.
4) TRIzol 400µL을 넣고 4℃에서 10분 동안 incubation한다.
5) Scraper로 dish를 긁어서 TRIzol을 모으고 labeling한 ep tube에 옮긴다.

RNA isolation

1) TRIzol sample에 Chloroform 100µL을 넣고 15초 vortexing 후 4℃/10min동안 incubation한다.
2) 15000 rpm/10 min으로 centrifugation한다.
3) 투명한 aqueous layer를 200µL 따서 새 ep tube에 옮긴다. 이때 흰색 막이 딸려오지 않도록 주의한다.

참고자료

· Rebouças, E. D. L., Costa, J. J. D. N., Passos, M. J., Passos, J. R. D. S., Hurk, R. V. D., & Silva, J. R. V. (2013). Real time PCR and importance of housekeepings genes for normalization and quantification of mRNA expression in different tissues. Brazilian Archives of Biology and Technology, 56(1), 143-154.
· Sigmon, J., & Larcom, L. L. (1996). The effect of ethidium bromide on mobility of DNA fragments in agarose gel electrophoresis. Electrophoresis, 17(10), 1524–1527.
· https://www.atcc.org/products/all/tib-71.aspx#characteristics
· https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/trizol_reagent.pdf
· https://www.bio.davidson.edu/projects/gcat/protocols/NanoDrop_tip.pdf
· https://www.bioneer.co.kr/literatures/manual/DNARNAmplification/PM-02-En(V2)_AccuPower_RT_PreMix.pdf
· https://www.bioneer.co.kr/literatures/manual/PM_004_En(V3)_Taq_DNA_polymerase.pdf
· http://microgiene.com/shop/item.php?it_id=1480481479&ca_id=90#sit_upload