면역염색법과 1차, 2차 항원항체반응을 이용해 SOX2, Nanog, oct3/4의 전사인자들을 detection하는 실험

소개

면역염색을 하는 실험입니다.

목차

1. 실험목적
2. 이론적배경
3. 실험준비물
4. 실험방법
5. 고찰
6. 결과

본문내용

이론적배경
면역염색은 특정 단백질에 대한 항체를 이용하여 western blotting의 membrane상에 항원항체 반응을 수행하는 것으로 특정 단백질을 검출하는데 사용하는 방법이다. 검출방법은 크게 직접법과 간접법으로 나뉘며, 최근에는 검출감도를 높이는 간접법이 일반적이다.
이 실험에서는 간접법으로 사용했으며, 특이적 항체(1차 항체)를 항원으로 인식하는 항체(2차 항체)를 표식하고, 그 표식을 검출하는 것으로 특정 단백질의 존재를 밝히는 방법. 2차 항체에는 특정의 동물종의 immuno globlin을 인식하는 항체를 이용하여, 1차 항체를 인식한다. 동일한 동물종 유래의 1차 항체인 경우 동일한 2차 항체를 이용할 수 있어 널리 이용되고 있다.

실험준비물
피펫, TIP, PBS, 4%의 파라포름알데하이드, 0.2% Triton-X, NGS, antibody1차(oct3/4), antibody2차, dish, 형광현미경, 라텍스 장갑, cover glass, watson jelly , 알루미늄 호일, 포셉, DAPi staining(mounting solution이 포함)

실험방법
1. 세포액들을 피펫으로 석션해 버린다.
2. PBS를 피펫으로 200μl 넣고, dish를 흔들어 준 후에 피펫으로 PBS를 석션해 버린다.
-이 과정을 두 번 반복한다.
3. 4%의 파라포름알데하이드 용액을 500μl 넣어준다.
4. 4%의 파라포름알데하이드를 피펫으로 석션하고 PBS 200μl로 세척한 다음에 석션해 버린다.
5. 0.2% Triton-X 500μl를 넣어준다.
6. Triton 피펫으로 석션하고, PBS 200μl로 세척한 후에 버린다.
7. Blocking단계 (비특이적 결합을 막는 역할을 한다.)
-NGS(Normal Goat Serum)을 500μl를 넣어준다.
8. Washing할 필요없이, Blocking NGS 석션하고, 바로 1차 Antibody 분주한다.(oct3/4)
9. PBS 200μl로 washing 2번 정도 하고 2차 Antibody를 넣는다.
10. PBS로 Washing 1번, DAPi staining을 10μl정도를 분주한다.

참고자료

· http://www.ibric.org/myboard/print.php?id=2549&Board=report
· http://www.kjorl.org/upload/pdf/0012011099.pdf
· http://www.ibric.org/myboard/read.php?id=205565&Board=exp_qna
· https://www.immunoreagents.com/protocols/view/20
· http://www.biology.arizona.edu/immunology/tutorials/antibody/structure.html
· https://www.rndsystems.com/products/mouse-rat-oct-3-4-primer-pair_rdp-335
· http://www.sinobiological.com/NANOG-protein-antibody-kit-gene-cDNA-clone-m03096.html?gclid=EAIaIQobChMI2djv6JTC3gIVQ6mWCh0XiwVlEAAYAiAAEgJot_D_BwE
· http://cms.takara.co.kr/file/lsnb/28_h_1.pdf
· https://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%9C%A0%EB%8F%84%EB%A7%8C%EB%8A%A5%EC%A4%84%EA%B8%B0%EC%84%B8%ED%8F%AC#Sox2