DNA cloning (Ligation) Restriction analysis of plasmid DNA

목차

Ⅰ. Materials

Ⅱ. Methods

Ⅲ. Result
1. 패턴 분석
2. 제한효소 buffer 선택

Ⅳ. Discussion
1. pGem T-easy vector system
2. restriction enzyme
3. EtBr staining
4. agarose gel electrophoresis
5. TAE buffer

Ⅴ. Reference

본문내용

Ⅰ. Materials
1.5ml microcentrifuge tube, EcoR 1, 10X H buffer, D.W., plasmid DNA, 1% agarose gel, 1/2TAE buffer, EtBr, UV gel illuminator, etc.

Ⅱ. Methods
1% Agarose gel 만들기

1. 삼각 플라스크에 0.5X TAE buffer를 원하는 용량만큼 50ml 부어준다.
2. 저울을 이용하여 0.5X TAE buffer의 1% 용량만큼의 agarose powder를 개량하여, magnetic bar와 함께 삼각 플라스크에 넣어준다.
3. 전자렌지에 agarose powder가 완전히 녹을 때까지 끓여준다.
4. Magnetic stirrer위에 올려놓은 후 stirrer가 돌아가도록 설정한 후 60-70℃ 온도까지 식으면, 미리 준비해 놓은 gel caster에 잘 부어서 굳혀준다.
5. 완전히 식으면 실험에 사용 혹은 0.5X TAE buffer를 담아놓은 통 안에 보관한다.

Retriction analysis of plasmid DNA

1. 추출한 plasmid DNA 2ul와 EcoRⅠ 0.5ul, 10X H buffer 1ul, D.W. 6.5ul를 넣은 후 tapping하여 잘 섞어준다.

<중 략>

1. TAE buffer
TAE는 긴 DNA(>12kb)를 전기 영동할 때 좋다. pH를 안정시키는 완충용액이다. 전기영동을 하면 DNA를 이동시켜야하는데 이 DNA의 운반체들이 이온들이며 이러한 이온을 buffer가 공급해준다. TAE buffer는 Tris-Cl, Acetate, EDTA로 구성되어있다.

Tris-cl
양이온을 공급한다. DNA는 (-) charge를 띠고 있기 때문에 이 buffer안에서 DNA는 음극에서 양극으로 끌려간다.
Acetate
Tris-cl의 pH가 거의 11에 가깝기 때문에 이 pH를 낮추기 위해서 첨가한다. pH가 11까지 높다면 DNA가 해리될 것이다.

참고 자료

남상욱 외 2인, 유전공학의 이해 제 2판, p53~55, p60~61
promega, pGem-Tand pGem-T easy vector systems manual
http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=xerxgus&logNo=70019747060&redirect=Dlog&widgetTypeCall=true
http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=gospel89&logNo=80083252084
http://blog.naver.com/gospel89/80083252084
http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=sksmstjdcns&logNo=50169276698