southern blot hybridization

소개

실험관련 그림파일이 첨부되어 있습니다. 그리고 한글2002파일입니다. 97로 변환했더니 편집한게 틀어지더군요..그래서 2002파일로 올립니다.

목차

실험과정

DNA 이동방법
1) Capillary transfer
2) Eletrophoretic transfer
3) Vacuum transfer

실험방법
1) Genomic DNA의 제한효소 절단
2) Capillary transfer 이용한 southern transfer
3) Hybridization

참고사항

참고자료

본문내용

Southern blot hybridization

1975년에 DNA조각을 전기영동하여 분리한 후 nitrocellulose(NC) filter에 옮겨서 특정 DNA 조각을 확인하는 것이 Southern에 의해 개발되었다. 이 방법은 특정 DNA 조각을 확인하는 것 이외에도 유전자의 copy수, transgenic animal에서의 외부 유전자 도입 여부의 확인, 유전자의 recombination, insertion, deletion의 검증, PCR product의 확인 등에 이용 될 수 있다. 이러한 Southern hybridization의 폭넓은 응용 가능성 때문에 분자생물학에서 중요한 기법의 하나로 자리잡게 되었다. 이후로 RNA를 동일함 방법으로 분석하는 기법이 개발되었고(Northern hybridization), 1979녀도에는 전기영동한 단백질을 NC filter에 transfer한 후 항체를 이용하여 특정 단백질을 분석해 내는 Western blotting이 개발되었다. 만약 앞으로 새로운 분석 방법이 개발된다면, 즉 남은 macromolecule인 lipid나 carbohydrate에 대한 분석 기법은 Eastern blotting으로 명명될 수도 있을 것이다.
Hybridization이란 한 가닥으로 된 핵산이 이와 상보적인 염기 서열의 또다른 한 가닥의 핵산과 적당한 조건에서 만나게 되면 이중나선(DNA-DNA or DNA-RNA)을 형성하는 현상이다. Southern hybridization은 위의 현상을 이용하는 기법이다. 먼저 genomic DNA나 plasmid DNA를 적당한 제한 효소로 자른 후 agarose gel 상에서 전기영동을 하여 크기별로 DNA조각을 분리한다. 이중나선 상태로 있는 DNA를 alkali로 단일 가닥 상태로 만들어 준 뒤 NC filter나 nylon membrane으로 옮긴다. 이때 gel 상에서의 DNA를 옮기는 방법은 capillary transfer와 vacuum transfer의 방법을 가장 많이 사용한다. Capillary transfer는 흡습지에 의해 transfer buffer가 빨아 올려지면서 buffer와 함께 DNA가 이동하여 membrane으로 옮겨지게 된다. Vacuum transfer에서는 진공으로 buffer의 흐름을 만들어 주게 되는데 단시간 내에 transfer를 완료할 수 있다는 장점이 있다. Membrane으로 옮겨진 DNA는 완전히 고정된 상태가 아니므로 80℃에서 2시간 동안 baking하거나 UV를 쬐어 줌으로서 membrane에 고정시킨다. Membrane의 특성상 핵산이 비특이적으로 달라붙을 수 있는 자리가 있기 때문에 prehybridization이라는 과정을 통해서 그 자리를 미리 메꾸어 주게 된다. 이어서 표지가 된 핵산(probe)을 만들어서 넣어 주면 이것이 membrane 산의 특정 핵산과 hybridization하게 되고 달아 준 표지에 따라 그것을 알아볼 수 있는 각각의 방법에 따라 특정 핵산의 조재를 확인하게 된다.

참고자료

· 없음