제한효소를 처리한 Vector의 self-ligation 현상을 방지하기 위한 방법

소개

제한효소를 처리한 Vector의 self-ligation 현상을 방지하기 위한 방법

목차

1. 서론 (self-ligation 이란?)
2. alkaline phosphatase(ALP) 방법
3. 두 가지의 제한효소 처리(double digestion) 방법

본문내용

Vector의 self-ligation을 방지하기 위한 방법
제한효소(restriction enzyme)와 ligase(연결효소)를 이용하여 Vector에 원하는 DNA를 삽입함으로써 재조합 DNA를 만들 수 있다. 그런데 이 과정에서 모든 Vector가 재조합 DNA가 되는 것이 아니라 원하는 DNA가 삽입되지 않은 채 DNA의 잘려진 부위가 스스로 다시 붙는 현상(self-ligation)이 일어나기도 한다. 제한효소를 처리한 Vector의 self-ligation 현상을 방지하기 위한 방법에는 alkaline phosphatase(ALP)를 처리해주는 방법과 두 가지 제한효소를 처리(double digestion)하는 방법이 있다.

(1) alkaline phosphatase(ALP) 방법
ligation은 -OH group과 Phosphate group이 phosphodiester bond를 만드는 것이다. 따라서 Phosphate group을 다 없애버리면 자연히 ligation은 일어나지 않는 것이다.
vector + foreign DNA(insert DNA) ligation 시 vector DNA의 self-ligation을 방지하기 위해 alkaline phosphatase 사용하여 vector DNA의 5`-phosphate를 제거하여 5`-OH로 만든다.

DNA ligation 후에 비정상적인 5`-OH 말단은 polynucleotide kinase로 처리함으로써 다시 정상적인 5`-phosphate 형태로 바뀌어 진다.

(2) 두 가지의 제한효소 처리(double digestion) 방법
blunt end의 ligation은 sticky end의 ligation에 비해 정확도와 방향성의 효율이 낮다. 따라서 유전자 클로닝실험에서 ligation을 위해선 sticky end가 유리하다.

참고자료

· 없음