gene cloning

목차

1. 실험목표
2. cloning 목적
3. gene
4. Arabidopsis thaliana(애기장대)
5. Cloning 방법
6. Vector(pGEX)
8. PCR : AtSRip1 gene 증폭
9. 1% Agarose gel 전기영동
10. Ethanol precipitation
11. 제한효소로 자르기
12. 전기영동후 gel elution
13. ligation
14. Heat shock transformation
15. Mini-prep(pDNA preparation)
16. 제한효소 처리
17. Transformation 유전자 발현 조절
18. SDS-PAGE
19. GST tag이용 fusion protein 분리, 정제

본문내용

1. 실험목표
식물(애기장대)에서 분리한 AtSRip1 gene을 발현 vector (pGEX)에 Cloning, 재조합 DNA를 가진 Clone으로 부터 AtSRip1 gene으로부터 발현되는 단백질을 분리 정제한다.

2. cloning 목적
cloning이란 유전자 및 같은 형질을 가진 개체의 집합(clone)을 만드는 과정
실험을 하기위해 식물체에서 직접 뽑기엔 양이 작고 cell debris에서 원하는 protein만 특이적으로 얻어내기가 어려우므로 cloning을 통해 원하는 protein을 만드는 gene을 얻어 cloning을 통해 protein을 얻는다.

3. gene
gene = coding sequence + non-coding sequence
= 5`UTR, promoter, ORF(start codon~stop codon), terminator, 3`UTR

4. Arabidopsis thaliana(애기장대)
① 애기장대 장점 : 반수체성장가능. 단순. genome 작다. 세대기간 짧다. 실내배양 가능.
② Wild type : 꽃대 길이가 길다.
Mutant type(AtSRip1) : 꽃대길이가 짧다.

5. Cloning 방법
insert DNA AtSRip1 gene분리 → PCR → Agarose gel → Ethanol precipitation → 제한효소로 Vector와 insert DNA 절단 → 전기영동 → Gel elution → Ligation → Transformation(XL1-blue) → 항생제 포함 배지 배양 → Mini-prep → 제한효소 처리 → agarose gel 전기영동 → 재조합 vector를 Transformation (BL21) → SDS-PAGE → fusion protein 분리, 정제 → SDS-PAGE로 단백질 확인

6. Vector(pGEX)
Vector로는 plasmid, virus(phage), cosmid

참고 자료

없음