연세대학교 생화학실험(2) - Subcloning Ⅱ, Detection of Subcloning

소개

Transformation 된 cell을 배양한 후, colony를 추출하여 mini prep하여 plasmid를 얻고, Restriction enzyme을 이용하여 cloning이 잘 되었는지 확인해 본다.

목차

◆ 실험일자
◆ 제출자
◆ 목적
◆ 원리
◆ 시약 및 기자재
◆ 방법
◆ 결과
◆ 고찰
◆ further study

본문내용

◆ 목적 : Transformation 된 cell을 배양한 후, colony를 추출하여 mini prep하여 plasmid를 얻고, Restriction enzyme을 이용하여 cloning이 잘 되었는지 확인해 본다.

◆ 원리
<Mini prep과 midi prep의 차이>
가장 근본적인 차이는 뽑는 DNA 양의 차이이다. mini prep은 거의 20kb 이하의 plasmid를 얻기 위해 사용하고 그 이상은 midi나 large prep으로 추출한다. 또한 Midi prep을 사용하면 DNA를 이론상으로는 500ug까지 뽑을 수 있다. 또한, midi-prep의 경우는 대부분 과정상에서 endo-cytotoxicity를 없애주기 때문에, transfection용 construct를 뽑을 때 많이 사용된다.
이렇게 결과적인 차이점 말고 실험 과정에서의 가장 큰 차이는 사용하는 DNA binding matrix 종류의 차이이다. Midi prep 혹은 Maxi prep 에서 사용하는 column의 resin은 anion exchange, 대개 DEAE 계열이다. 보통 중성의 버퍼에서 DNA는 인산기 때문에 강한 negative charge 를 띄고, anion exchanger 에 매우 잘 붙고, 대략 0.5M정도의 염 농도에서도 떨어지는 단백질과는 달리, DNA 의 경우에는 1.5M 정도까지 염 농도를 올려야 column에서 떨어진다. 이러한 원리를 이용하여 washing을 할 때에는 DNA 는 안 떨어지고 Protein, RNA 등은 떨어지는 정도로 Washing Buffer 를 만들어 사용하고, elution 할 때에는 이보다 더 높은 Salt 농도를 가진 버퍼로 elution해준다. 대개 midi prep 하는 경우에는 elution한 다음에 isopropanol로 centrifuge하는데, 이는 elution buffer 내에 Salt 농도가 너무 높기 때문에 DNA를 정제하기 위한 단계이다..

참고자료

· - 생화학실험(2) 실험교본, 연세대 생화학과.
· - http://bric.postech.ac.kr/myboard/read.php?id=78357&Page=1&Board=exp_qna&
· - http://blog.naver.com/dextermh?Redirect=Log&logNo=10010236507
· - http://catalog.takara-bio.co.jp/en/product/basic_info.asp?unitid=U100005230