[결과레포트] In-sol digestion

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목차

1. Subject
2. Date & Experiment
3. Discussion
4. Reference

본문내용

1. Subject
: In-sol digestion

4. Date & Experiment
[전체 순서]
① Denaturation → ② Reduction → ③ Alkylation → ④ Dilution → ⑤ Digestion

[Buffer]

Dilution buffer
100mM ABC buffer (pH 8.0)
Denaturation
8M urea
Reduction
1M DTT
Alkylation
1M IAA
Digestion
sample : trypsin = 50 : 1 의 trypsin suspension

[Procedure]
1) Denaturation(45min)
① urea의 농도가 적어도 6M이 되도록 sample, ABC buffer ( pH 8.0 ) 와 혼합한다.

제작 방법 : 100 μl solution = 75 μl 8M urea + 25 μl sample ( 90 μg )
* volume이 최소 100 μl가 되어야 한다. ( 다음 step에서 1M DTT를 100배 희석하는 단계가 있기 때문이다.)

② Sonication (10min), vortexting (30sec~1min), spindown의 과정을 3번 반복한다.
(in RT)

2) Reduction (1hr)
① 위 용액에 1M DTT를 넣어 10mM의 농도가 되게 한다.

DTT (154.3g/mol) → 4개 조 분량

② at RT, 45min ~ 1hr 반응한다.

3) Alkylation (30min)
① 위 용액에 1M IAA를 넣어 30mM의 농도가 되게 한다.

IAA (184.96g/mol) → 4개 조 분량

*아주 적은 양이므로 팁을 깊게 넣고 DTT를 넣는다.

② 암실, 30min 반응한다.

4) Dilution
① urea의 농도가 1M 이하가 되도록 ABC buffer (pH 8.0) 로 희석한다.
* 첫 단계의 buffer와 맞추는 것이 중요하다.(Tris를 써도 된다.)
* dilution하는 이유는 trypsin도 protein이기 때문에 urea에 의해 denaturation 되므로, 그것을 방지하기 위해 urea의 농도를 옅게 하는 것이다.

참고 자료

Linda Switzar Martin Giera and Wilfried M. A. Niessen / Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments / J. Proteome Res. 2013, 12, 3, / pp. 1067–1077
Katelyn R. Ludwig, Monica M. Schroll, Amanda B. Hummon / Comparison of In-Solution, FASP, and S‑Trap Based Digestion / Journal of Proteome Research 2018 17 (7) / pp. 2480-2490
[위키백과] 탈염과 완충액 교환 / https://ko.wikipedia.org/wiki/%ED%83%88%EC%97%BC%EA%B3%BC_%EC%99%84%EC%B6%A9%EC%95%A1_%EA%B5%90%ED%99%98 / 2021-05-03
[ThermoFisher SCIENTIFIC] Desalting and Gel Filtration Chromatography / https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/desalting-gel-filtration-chromatography.html / 2021-05-04