대장균에서 재조합 단백질의 생산과 Western blot에 관한 실험

문서 내 토픽

• 1. IPTG

  IPTG는 대장균 lactose operon의 효소합성을 유도하는 강력한 유도물질이다. 보통 유도물질은 operon의 활동에 의해 만들어지는 β-D-galactosidase에 의해 대사 이용하는 것이 많지만, IPTG는 분해되지 않아 비대사성 유도물질이라고도 불린다. 또한, 고농도로 사용시 galactoside permease가 없는 세포에도 투과할 수 있기 때문에 permease가 없는 균주에서의 유도실험에도 사용된다.

• 2. Buffer condition

  Tank buffer에는 glycine과 Cl-(Tris-base)이온이 들어간다. Glycine은 아미노산의 성질로 인해 음전하를 띠거나 net charge가 0인 쌍극성 이온 형태로 존재한다. Transfer buffer에는 단백질이 SDS로 인해 (-)전하를 띠어 gel에서 membrane으로 이동되도록 한다. methanol은 SDS와 결합한 단백질이 membrane에 잘 결합되도록 도와주는 역할을 한다.

• 3. Protein extraction method

  세포막은 주로 인지질 이중층과 다양한 단백질로 구성된 반투과성 원형질막이다. 생명체로부터 단백질을 추출하고, 분리 및 동정을 위해서는 세포막을 파쇄하고 세포 내 대사체를 변형없이 안정하게 추출해야한다. Sonication법은 고주파 진동으로 세포막 구조를 파괴시키는 방법이며, lysozyme은 세포벽 구성 물질인 peptidoglycan을 분해하는 효소이다.

• 4. Protein loading buffer

  SDS Loading buffer는 단백질 denaturation을 도와주는 역할로, SDS가 polypeptide backbone을 감싸 고유의 charge를 잃어버리고 SDS에 의해 (-)전하를 띠게 된다. pH 8.0을 맞추기 위해 Tris-HCl이 들어갔으며, 잘 침전되도록 Glycerol이 들어갔다. Bromophenol blue는 염색을 위함이다.

• 5. SDS-PAGE

  SDS-PAGE는 단백질을 구성하는 펩티드의 분자량을 결정하는 방법이다. SDS는 단백질에 강하게 결합하여 단백질을 subunit까지 해리한다. 전류가 gel을 통해 흐르면 음전하를 띤 단백질은 양극(anode)으로 이동하게 되는데, 분자량이 작은 단백질이 큰 단백질보다 이동 속도가 더 빠르기 때문에 단백질은 크기별로 분리된다.

• 6. Transfer

  SDS-PAGE로 단백질을 크기에 따라 분리한 이후에는 분리된 단백질을 gel에서 nitrocellulose나 PVDF막과 같은 단단한 막에 transfer 시킨다. 전기영동 전이 방법 중 wet 전이로 gel과 membrane이 transfer buffer에 완전히 잠긴 상태에서 단백질을 gel로부터 PVDF 막으로 전이한다.

• 7. Blocking & Western blot analysis

  Transfer 이후에는 특정 단백질 항원에 대해 반응하는 항체를 이용해 단백질을 검출한다. PVDF 막에서 단백질이 전이되지 않은 부분에 다른 단백질이 오염되어 이로 인한 항체와의 비특이 반응을 막기 위해 BSA나 skim milk로 blocking 처리한다. 1차 항체와 2차 항체를 사용하여 특정 단백질을 탐지한다.

• 8. 실험 결과

  본인의 조(3조)에서 IPTG 처리를 한 경우 단백질 발현이 잘 되었음을 확인할 수 있었다. 이는 BL21(DE3)에 형질전환 시킨 vector가 T7 promoter를 가짐을 유추해볼 수 있다. IPTG 처리를 하지 않은 경우에는 단백질 band가 나타나지 않았다.

• 9. 실험 결과 분석

  IPTG 처리를 통해 대장균에서 재조합 단백질의 생산이 잘 유도되었음을 확인할 수 있었다. 다른 조의 경우 IPTG 처리를 했음에도 불구하고 단백질 band가 제대로 나오지 않은 것은 OD600이 exponential phase에 속하는 값이 아니었거나, IPTG induction이 제대로 되지 않았거나, Sonication 후 단백질들이 모두 펠렛으로 떨어져 버렸기 때문으로 추측된다.

• 10. Western blot의 활용

  Western blot은 항원-항체 반응의 특이성을 이용해 단백질을 검출할 수 있다. 전기영동에서 단백질의 검출에 사용하는 방법보다 훨씬 민감하기 때문에 소량의 단백질도 검출이 가능해 널리 사용된다.

• 11. 실험의 의의

  이번 실험을 통해 IPTG를 사용하여 대장균에서 재조합 단백질을 생산 및 유도해내고, Western Blot으로 결과를 확인할 수 있었다. 이는 생화학적 연구에서 목표하고자 하는 단백질을 특이적으로 검출하는데 활용될 수 있다.

Easy AI와 토픽 톺아보기

• 1. IPTG

  IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)는 대장균에서 유전자 발현을 유도하는 데 널리 사용되는 합성 유도제입니다. IPTG는 lac 오페론의 억제자인 LacI 단백질과 결합하여 이를 불활성화시킴으로써 lac 프로모터의 활성화를 유도합니다. 이를 통해 목적 단백질의 발현을 효과적으로 유도할 수 있습니다. IPTG의 농도, 처리 시간 등은 발현 수율과 단백질의 활성에 중요한 영향을 미치므로, 실험 목적에 맞게 최적화된 조건을 설정하는 것이 중요합니다.

• 2. Buffer condition

  실험에 사용되는 버퍼 조건은 단백질의 구조와 활성을 유지하는 데 매우 중요합니다. pH, 이온 강도, 첨가제 등 버퍼 조성은 단백질의 용해도, 안정성, 활성 등에 영향을 미칩니다. 따라서 목적 단백질의 특성을 고려하여 적절한 버퍼 조건을 선택하는 것이 필요합니다. 예를 들어, 단백질의 등전점에 가까운 pH에서는 단백질의 용해도가 낮아질 수 있으므로, 이를 고려하여 pH를 조절해야 합니다. 또한 환원제, 킬레이트제, 계면활성제 등의 첨가제는 단백질의 안정성과 활성에 영향을 줄 수 있으므로 적절한 농도로 사용해야 합니다.

• 3. Protein extraction method

  단백질 추출 방법은 목적 단백질의 특성과 실험 목적에 따라 선택되어야 합니다. 일반적으로 세포 파쇄, 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법이 사용됩니다. 세포 파쇄 시에는 세포벽 및 막 단백질의 변성을 최소화하기 위해 적절한 물리적/화학적 처리 방법을 선택해야 합니다. 또한 단백질의 변성을 방지하기 위해 저온, 환원제, 단백질 분해 억제제 등을 사용할 수 있습니다. 추출된 단백질은 순도와 활성을 확인하고, 실험 목적에 맞게 정제 및 농축 과정을 거치게 됩니다.

• 4. Protein loading buffer

  단백질 시료를 SDS-PAGE에 로딩할 때 사용되는 로딩 버퍼는 단백질의 변성, 용해도, 전하 등을 조절하여 효과적인 전기영동을 가능하게 합니다. 일반적으로 SDS, 환원제, 글리세롤, 염료 등이 포함된 버퍼를 사용합니다. SDS는 단백질의 2차 및 3차 구조를 변성시켜 일정한 음전하를 부여하고, 환원제는 이황화 결합을 끊어 단백질을 완전히 변성시킵니다. 글리세롤은 시료의 밀도를 높여 전기영동 시 시료가 잘 가라앉도록 하며, 염료는 단백질 밴드의 가시화를 돕습니다. 이러한 로딩 버퍼의 조성은 단백질의 특성과 실험 목적에 맞게 최적화되어야 합니다.

• 5. SDS-PAGE

  SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)는 단백질의 분자량을 분석하는 대표적인 기법입니다. SDS는 단백질의 2차 및 3차 구조를 변성시켜 일정한 음전하를 부여하므로, 단백질은 분자량에 비례하여 이동합니다. 이를 통해 목적 단백질의 순도와 분자량을 확인할 수 있습니다. SDS-PAGE 수행 시 gel 농도, 전압, 전류 등의 조건을 최적화하여 단백질 분리능을 높일 수 있습니다. 또한 표준 단백질 마커를 함께 전기영동하여 목적 단백질의 분자량을 정확히 측정할 수 있습니다. SDS-PAGE는 단백질 정제, 발현 분석, 분자량 확인 등 다양한 실험에 활용됩니다.

• 6. Transfer

  Western blot 분석을 위해서는 SDS-PAGE로 분리된 단백질을 PVDF 또는 니트로셀룰로오스 막으로 전이(transfer)하는 과정이 필요합니다. 이때 전압, 전류, 시간 등의 조건을 최적화하여 효과적인 단백질 전이를 달성해야 합니다. 전이 효율은 단백질의 크기, 전하, 소수성 등에 따라 달라지므로, 목적 단백질의 특성을 고려하여 적절한 전이 조건을 선택해야 합니다. 또한 전이 과정에서 단백질의 변성을 최소화하고 막 결합력을 높이기 위해 메탄올, 완충액 등의 첨가제를 사용할 수 있습니다. 전이 효율을 확인하기 위해 단백질 염색 등의 방법을 활용할 수 있습니다.

• 7. Blocking & Western blot analysis

  Western blot 분석에서 blocking 단계는 비특이적 결합을 차단하여 특이적 항원-항체 반응을 유도하는 데 매우 중요합니다. 일반적으로 BSA, 탈지유, 젤라틴 등의 단백질 용액을 사용하여 막 표면의 빈 공간을 차단합니다. 이후 1차 항체와 2차 항체를 순차적으로 반응시켜 목적 단백질을 검출합니다. 항체의 농도, 반응 시간, 온도 등의 조건을 최적화하여 특이성과 감도를 높일 수 있습니다. 또한 세척 과정을 통해 비특이적 결합을 제거하고, 발색 시약을 사용하여 목적 단백질 밴드를 가시화할 수 있습니다. Western blot 분석은 단백질의 발현 수준, 변형, 상호작용 등을 확인하는 데 널리 활용됩니다.

• 8. 실험 결과

  실험 결과는 실험 목적에 맞게 체계적으로 정리되어야 합니다. 단백질 발현 수준, 분자량, 순도 등의 정량적 데이터와 함께 Western blot 이미지와 같은 정성적 데이터를 제시할 수 있습니다. 실험 결과를 통해 목적 단백질의 특성을 명확히 확인하고, 실험 조건의 최적화 여부를 판단할 수 있습니다. 또한 실험 결과를 통계적으로 분석하여 유의성을 검증하고, 실험 간 재현성을 확인하는 것이 중요합니다. 실험 결과는 논리적으로 정리되어 실험 목적과 방법에 부합하는 해석이 제시되어야 합니다.

• 9. 실험 결과 분석

  실험 결과 분석 시에는 목적 단백질의 발현 수준, 분자량, 순도 등의 정량적 데이터와 Western blot 이미지와 같은 정성적 데이터를 종합적으로 고려해야 합니다. 이를 통해 실험 조건의 적절성, 목적 단백질의 특성, 실험 간 재현성 등을 종합적으로 평가할 수 있습니다. 또한 통계적 분석을 통해 실험 결과의 유의성을 검증하고, 실험 간 편차를 최소화할 수 있습니다. 실험 결과 분석 시에는 실험 목적과 방법에 부합하는 논리적인 해석이 제시되어야 하며, 추가적인 실험이 필요한 경우 이에 대한 제안도 포함되어야 합니다.

• 10. Western blot의 활용

  Western blot 분석은 단백질 발현, 변형, 상호작용 등을 확인하는 데 널리 활용되는 기법입니다. 이를 통해 특정 단백질의 발현 수준, 분자량, 인산화 상태 등을 확인할 수 있으며, 단백질 간 상호작용 및 복합체 형성을 분석할 수 있습니다. 또한 Western blot은 약물 스크리닝, 질병 진단, 생물학적 지표 발굴 등 다양한 분야에서 활용됩니다. 최근에는 정량적 Western blot, multiplexing, 자동화 등의 기술 발전으로 Western blot의 활용도가 더욱 높아지고 있습니다. 이러한 Western blot 기술의 발전은 단백질 연구와 응용 분야에 큰 기여를 할 것으로 기대됩니다.

• 11. 실험의 의의

  본 실험은 단백질 발현, 정제, 분석 기술을 활용하여 목적 단백질의 특성을 체계적으로 확인하는 데 그 의의가 있습니다. IPTG 유도, 단백질 추출, SDS-PAGE, Western blot 등의 기법을 통해 단백질의 발현 수준, 분자량, 순도 등을 분석할 수 있었습니다. 이를 통해 목적 단백질의 특성을 명확히 이해하고, 실험 조건의 최적화 방향을 제시할 수 있습니다. 또한 Western blot 분석은 단백질의 변형, 상호작용 등을 확인하는 데 활용될 수 있어, 단백질 기능 연구와 응용 분야에 기여할 수 있을 것으로 기대됩니다. 이러한 단백질 분석 기술의 발전은 생명과학 연구와 바이오 산업 발전에 중요한 역할을 할 것입니다.