wnt/B-catenin signaling activation full-report

소개글

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목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Materials & Methods
4. Data & Results
5. Discussion
6. Reference

본문내용

형광현미경으로 transfection의 효율을 확인하고 -catenin inhibition 인자를 inhibition 하여 western blot, image J를 이용해 -catenin 발현량 증가를 확인해 본다.
Transfection은 동물세포 내로 외부 유전물질을 도입하는 것을 의미한다. Polymer, liposome 등의 물질을 이용하여 DNA와 membrane 사이의 전기적 반발력을 억제한 후 세포 내로 도입 시킬 수 있다. 세포막을 파괴하여 세포의 구성요소를 노출시켜 Lysate를 얻는 과정을 cell lysis라고 한다. Bradford assay는 농도를 미리 알고 있는 sample과 흡광도 간의 관계식을 얻어내 미지 시료의 농도를 결정하는 기법이다. Western blot은 항체를 이용하여 단백질을 분석, 검출해내는 방법이다. Cell로부터 얻은 단백질을 size 별로 분리하고 membrane에 옮긴 후 blocking하여 항체를 처리한다. 2차 항체에 alkaline phosphatase(AP)가 conjugation 되어 있는데 BCIP/NBT Solution을 넣어주면 AP가 이와 반응해 색소를 형성한다. 이로 인해, detection이 가능하다.
먼저, HEK293T cell을 배양하고 Human -catenin(GFP-tagged) plasmid를 HEK293T cell에 transfection 한다. Cell lysis를 통해 lysate를 얻어내고 Bradford assay를 이용해 농도를 결정한다. 이후, SDS-PAGE를 진행하여 단백질을 size별로 분리해낸 후 PVDF membrane을 이용해 transfer과정을 진행한다. 5% Skim milk solution으로 blocking 하고 1,2차 항체를 순서대로 처리한다. 이후, membrane을 Ponceau S로 염색한 결과와 membrane에 BCIP/NBT solution을 뿌려준 결과를 확인한다. Image J로 membrane의 -catenin 발현량 차이를 비교해본다.

참고 자료

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