11주차_sequencing BL21 transformation

목차

I. Purpose

II. Theory
1. Sanger sequencing
2. Competent cell(BL21(DE3))

III. Apparatus/reagent

IV. Procedure
1. Cloning 실험 이후 (preculture)
2. Preculture 다음날
3. 11주차 실험수업 당일

V. Data&Results

VI. Discussion

본문내용

Purpose: Sequencing의 원리를 이해하고, 실제로 sequencing을 수행하여 cloning이 잘 되었는지 확인해볼 수 있다.

Theory
1. Sanger sequencing
sanger sequencing은 frederick sanger에 의해 1977년 개발된 방법으로, 500bp 이하의 DNA sequence를 결정할 때, 99.99% 가량의 매우 높은 정확도를 보인다. 이 방법은 DNA polymerase에 의한 DNA 중합 과정 중 template DNA sequence와 상보적인 염기가 결합된다 는 성질을 이용하기 때문에 chain termination method 또는 dideoxynucleotide termination method라고 부르기도 한다. 앞서 언급한 이름에서 알 수 있듯이 sanger sequencing은 DNA polymerization에 사용되는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP와 비슷한 구조를 갖기 때문에 DNA polymerase에 의해 인식될 수 있는 ddNTP를 이용한다. ddNTP는 dNTP와 유사하지만, 3’-OH 기가 없기 때문에 5’에서 3’ 방향으로 중합이 한 번 일어난 후, 다음 nucleotide가 연달아서 결합할 수 없다.
실제로 sequencing 반응을 진행할 때는 총 4개의 반응 튜브가 필요하다. 각각의 튜브에는 모두 동일한 농도의 반응물(template으로 사용할 ssDNA, 중합 반응 개시를 위한 primer, substrate로 사용될 dNTP, sequenase… )을 넣고 polymerization을 진행한다. 그리고, 반응 도중 에 4개의 튜브에 각각 ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP를 dNTP의 1/100만큼 첨가하면 서로 다른 속도로 중합되어 다른 길이를 가진 DNA molecule에 무작위하게 ddNTP가 결합되면서 polymerization 반응이 중단된다.

참고 자료

Jeremy M.Berg, Biochemistry, 8th, W. H. Freeman, 2015, pp145-153, 176-191